Plantes génétiquement modifiées
Étape 1: Identifier, isoler, intégrer et multiplier un gène d'intérêt
Dans cette première partie, nous allons voir les différentes techniques qu’emploient de nos jours les scientifiques pour la fabrication de PGM. En effet, ces méthodes sont multiples et il est ainsi possible d’en distinguer deux grandes grandes catégories : le transfert direct et le transfert indirect. Mais avant tout transfert, les scientifiques se focalisent dans la sélection d’un gène d’intérêt qui sera par la suite greffé dans le génome de la plante à modifier.
L’identification du gène d’intérêt
Avant de commencer toute manipulation, il est fondamental de bien repérer le gène d’intérêt possédant la fonction précise que l’on désire insérer dans l'organisme. Ce gène peut provenir de tout organisme vivant, plante, animal ou bactérie, et cela grâce à l’universalité du code génétique.
Après l’avoir repéré, il faut l’isoler de l'organisme d’origine. Ainsi, l’étape de transfert peut avoir lieu.
La sélection du gène
La première phase du transfert consiste à identifier le gène responsable d’une caractéristique qu’on veut insérer dans l’organisme, c'est-à-dire le gène d'intérêt : pour cela, il faut séquencer l’ADN de l’organisme donneur du gène. On fragmente celui-ci avec une enzyme dite de restriction.
Le gène est isolé, purifié et multiplié : il est soit cloné, soit produit en grande quantité au moyen d’un PCR (Polymerase Chain Reaction), méthode de biologie moléculaire in vitro.
On réalise ensuite une construction moléculaire qui comporte :
- un promoteur, c'est à dire une séquence placée en amont du gène et qui est nécessaire à sa transcription,
- le gène d’intérêt,
- un site de terminaison, séquence présente en aval et au niveau de laquelle l'élongation de l'ARN prend fin.
Un gène marqueur peut y être intégré pour localiser et sélectionner les organismes qui sont susceptibles d’exprimer le transgène.
Cet ensemble est inséré dans un plasmide pour être multiplié. Les scientifiques doivent préparer un plasmide où l'on incorpore le gène d'intérêt, ainsi que deux autres gènes qui permettent la transformation génétique. La plupart du temps, l'un sert à résister à un antibiotique A et l'autre à un herbicide H. Un plasmide est une molécule d'ADN circulaire naturelle ou modifiée artificiellement dans le but de l'utiliser en recherche biologique. Le plasmide étant préparé, il faut l'insérer dans une bactérie, de l'espèce Escherichia Coli qui possède la caractéristique de se dupliquer très rapidement.
On cultive ensuite cette bactérie qui va se reproduire très rapidement pour former d'autres bactéries qui possèdent toutes le plasmide incorporé. Pour vérifier si le gène de résistance à l'antibiotique agit, on incorpore l'antibiotique A dans la culture. On enlève ensuite les bactéries qui n'ont pas résisté et on se retrouve donc avec des bactéries possédant le plasmide initial.
=> Identifier et isoler le gène d'intérêt
La construction d'un transgène débute par le repérage d'un caractère intéressant et l'identification de la protéine responsable de ce caractère, puis du gène codant pur cette protéine.
Par exemple, chez une bactérie, Bacillus thuringiensis, utilisée en pulvérisation pour lutter contre certains papillons ravageurs des cultures de maïs, on a découvert le gène qui permet la production chez la bactérie d'une protéine qui se transforme en toxine dans le tube digestif de la pyrale. (Voir onglet "Mais Bt")
C'est ce gène d'intérêt qui a ensuite été isolé à l'aide d'enzymes de restriction.
=> Intégrer le gène d'intérêt dans une construction génétique
Le gène d'intérêt seul ne peut pas s'exprimer dans la cellule végétale.
- Les séquences régulatrices
Il est nécessaire de lui ajouter des signaux de régulation. La présence d'un promoteur devant la séquence codante du gène d'intérêt est indispensable. C'est une séquence située en amont du gène, responsable de la transcription de l’ADN. Une séquence terminateur est également indispensable. Située en aval, elle signale la fin de la séquence codante.
D'autres séquences peuvent être ajoutées. Elles permettent de cibler le lieu d'accumulation du produit du gène dans la plante, et de réguler la force de son expression.
- Les gènes marqueurs
Les gènes marqueurs permettent de repérer et de sélectionner, au cours des étapes suivantes de la transformation génétique les cellules ayant intégré le gène d'intérêt. Il peut s'agir de gènes marqueurs de résistance à des antibiotiques ou à des herbicides. Les cellules transgéniques sont alors sélectionnées par l'expression de leur résistance dans un milieu contenant l'antibiotique ou l'herbicide.
Tous ces fragments de gènes d'origines différentes, gènes d'intérêt, gènes marqueurs et signaux, sont assemblés in vitro. On obtient ainsi la construction génétique qui est multipliée puis utilisée pour l'étape de transformation.
Schéma récapitulatif
